帶你了解HPLC法測定有關物質時已知雜質的計算方法
HPLC法測定有關物質中已知雜質的測定方法很多, 計算方法也相應很多。每種計算方法都有不同的意義及其優(yōu)缺點, 下面參考國內外藥品標準和相關期刊文獻, 結合在藥品檢驗中的實際工作, 對這些計算方法作一簡單探討。
表1是各種計算方法的計算公式及其主要優(yōu)缺點 主成分對照品外標法 《美國藥典》多采用加校正因子或不加校正因子的主成分對照品外標法來對已知雜質進行計算。 方法介紹 主成分對照品外標法包括加不校正因子的主成分對照品外標法和加校正因子的主成分對照品外標法。 操作、計算分別與不加校正因子和加校正因子的主成分自身對照法基本一樣，唯一不同的是前者要用主成分對照品制備一個濃度與雜質限度相當的溶液作為對照品溶液, 后者是由供試品溶液直接稀釋得到一個濃度與雜質限度相當的溶液作為對照溶液。 優(yōu)缺點 由于主成分對照品是經過標定的, 其純度或量值會比較準確, 而制劑中主成分的實際含量與標示量有時會不完全一致, 因此采用對照品外標法計算出的雜質的實際絕對含量要比自身對照法準確一些。 當然, 由于本法要使用主成分對照品，從而導致操作成本會提高一些, 操作過程會繁瑣一些。 雜質對照品外標法 方法介紹 雜質對照品外標法要求提供一定純度的雜質對照品, 分析時需制備一個濃度應與雜質限度相當的溶液作為雜質對照品溶液。由于雜質對照品外標法可以解決上述幾種測定方法和計算方法存在的種種問題, 特別是雜質與主成分響應不一致的問題, 因此, 本法能反映藥品中該雜質的真實含量。 優(yōu)缺點 如果雜質對照品容易獲得并能持續(xù)供應, 建議在有關物質檢查中已知雜質的測定和計算時首選該法, 特別是當該雜質與主成分的相對響應因子相差較大(超出0.9 ～ 1.1范圍)或該雜質有毒副作用時, 歐美藥典中采用此法進行有關物質計算的品種也不在少數。 圖片來源于網絡，侵刪 加轉換因子的雜質對照品外標法 方法介紹 加轉換因子的雜質對照品外標法其實也是雜質對照品外標法的一種。 本法的操作方法與測定方法同雜質對照品外標法一樣, 不同的是在計算公式中多乘以一個轉換因子, 其意義就是把樣品中某一雜質的含量轉換成相當于主成分本身的重量百分比水平。 優(yōu)缺點 結果較準確。但由于雜質的分子量可能大于或小于主成分的分子量(即主成分的分子量/雜質的分子量可能小于1或大于1), 因此采用本法計算出的某一雜質的含量結果也可能比面積歸一化法、主成分自身對照法、主成分對照品外標法和雜質對照品外標法計算出的結果偏低或偏高。 主成分對照品外標法 方法介紹 加轉換因子和校正因子的主成分對照品外標法其實也是主成分對照品外標法的一種, 就是在加校正因子的主成分對照品外標法的基礎上乘以轉換因子。 優(yōu)缺點 結果較準確。但由于雜質的分子量可能大于或小于主成分的分子量(即主成分的分子量/雜質的分子量可能小于1或大于1), 因此采用本法計算出的某一雜質的含量結果也可能比面積歸一化法、主成分自身對照法、主成分對照品外標法和雜質對照品外標法計算出的結果偏低或偏高。 圖片來源于網絡，侵刪 內標法 方法介紹 按各品種項下的規(guī)定, 分別精密量取含有一定濃度內標物質的對照品溶液和供試品溶液, 注入液相色譜儀, 記錄色譜圖, 測定對照品溶液中對照品和內標物質的峰面積及供試品溶液中待測成分(這里指待測雜質)和內標物質的峰面積。 優(yōu)缺點 內標法主要是為了解決儀器進樣精密度和藥物中所含成分的回收率的問題, 這種方法可以抵消儀器和過程帶來的誤差。但在以常壓六通閥定量環(huán)進樣和回收率已經驗證的情況下, 意義已不大, 加之內標物質的選擇比較困難, 內標物質的添加會導致分離難度的增大, 操作過程更加煩瑣等問題, 本法已經使用很少。 面積歸一化法 優(yōu)缺點 具有與稱樣量及進樣量基本不相關的特點, 因此重復性和重現性均良好, 不需要折算, 降低了實驗中對稱樣量精密度的要求, 降低了檢驗成本, 操作更加簡便、快捷, 省去了計算過程。 但當雜質是微量的時候需增加方法的靈敏度, 就要增加進樣量, 此時主成分可能超出儀器檢測范圍, 或雖然在儀器檢測范圍內, 理論上講此時可能與主成分不在同一線性范圍內。 正是由于各雜質的響應因子不同、含量較低和需要較寬的線性范圍等因素的影響,《中國藥典》2005年版二部附錄中特別強調“本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規(guī)定外, 一般不宜用于微量雜質的檢查” 這也在一定程度上限制了本法的使用。 不加校正因子的主成分自身對照法 此方法是現行版《中國藥典》和其他國家藥品標準及藥品研發(fā)時制定的質量標準中應用最多、最廣泛的有關物質的測定方法和計算方法。 方法介紹 配制一個濃度與雜質限度相當的供試品溶液作為對照溶液, 一般是由供試品溶液直接稀釋得到。本法不需要雜質對照品, 當無法獲得雜質對照品時, 可采用不加校正因子的主成分自身對照法來計算雜質的含量。 同面積歸一化一樣, 本法也是在假定供試品溶液中所有成分均出峰、所有雜質均與主成分分離且各雜質和主成分的響應因子均相同的前提下進行的。 優(yōu)缺點 同面積歸一化一樣, 本法的優(yōu)點是操作簡單、運算方便, 無需雜質對照品;缺點是忽略了各雜質與主成分的響應因子可能不同的事實, 導致了實驗測得的雜質含量可能與真正的雜質含量不一致。 圖片來源于網絡，侵刪 加校正因子的主成分自身對照法 目前在國內應用較少, 但在國外藥品標準中應用比較廣泛。 方法介紹 該方法的操作步驟基本與上法相同, 唯一不同的是在計算時把雜質相當于主成分的響應因子考慮進去。本法相當于一個簡化的內標法, 同時也是對雜質對照品外標法的簡化, 即在研究方法學時, 利用雜質對照品和主成分對照品, 分別測定雜質和主成分的線性方程, 以斜率之比計算雜質相對于主成分的校正因子, 此校正因子可直接載入質量標準中, 在常規(guī)檢驗時用以校正該雜質的實測峰面積。在實際測定時, 可采用相對保留時間進行雜質定位。 優(yōu)缺點 此法的優(yōu)點是在日常檢驗中省去了雜質對照品(特別是在雜質不夠穩(wěn)定或將來供應有困難時顯得尤其重要), 同時又考慮到了雜質與主成分的響應因子可能不同所引起的測定誤差;缺點是相對保留時間在不同實驗室間可能有所波動, 特別是當供試品中存在多個雜質而又分離不好時可能造成雜質定位困難。 需要指出的是，如果已知雜質對主成分的相對響應因子超出0.9 ～ 1.1范圍時, 宜用加校正因子的主成分自身對照法或雜質對照品外標法法進行計算。
此外, 不加校正因子的主成分自身對照法會存在稀釋步驟、進樣針和進樣閥殘留、進樣誤差等影響因素, 往往也會導致計算出的雜質與真實含量之間存在一定的誤差；但不加校正因子的主成分自身對照法可以解決面積歸一化法中可能出現的儀器檢測范圍和線性范圍問題。
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